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RIP技(ji)術(shu)（RNA結(jie)合蛋白免疫沉淀）

RIP技術（RNA Binding Protein Immunoprecipitation，RNA結合蛋(dan)白免疫沉(chen)淀），是(shi)研(yan)究(jiu)細胞內RNA與蛋(dan)白(bai)結(jie)合情況的技術。分(fen)析(xi)與目的(de)蛋(dan)白(bai)結(jie)(jie)合(he)(he)的(de)RNA.運(yun)用針對目標蛋(dan)白(bai)的(de)抗(kang)體把(ba)相應的(de)RNA-蛋(dan)白(bai)復合(he)(he)物(wu)沉(chen)淀下來(lai)(lai)，然后經過分(fen)離純化就可以(yi)對結(jie)(jie)合(he)(he)在復合(he)(he)物(wu)上(shang)的(de)RNA進行分(fen)析(xi)；即用抗(kang)體或表位標記物(wu)捕獲細胞(bao)核內或細胞(bao)質(zhi)中內源性(xing)(xing)的(de)RNA結(jie)(jie)合(he)(he)蛋(dan)白(bai)，防止非(fei)特異性(xing)(xing)的(de)RNA的(de)結(jie)(jie)合(he)(he)，免疫沉(chen)淀把(ba)RNA結(jie)(jie)合(he)(he)蛋(dan)白(bai)及其結(jie)(jie)合(he)(he)的(de)RNA一起分(fen)離出來(lai)(lai)，結(jie)(jie)合(he)(he)的(de)RNA序列可通過microarray（RIP-Chip），定(ding)量(liang)RT-PCR或 高(gao)通量(liang)測序（RIP-Seq）方(fang)法(fa)來(lai)(lai)鑒(jian)定(ding)。是(shi)了解轉錄后調控網絡(luo)動態過程(cheng)的(de)有力工具(ju)，能(neng)幫助(zhu)我們發現(xian)miRNA的(de)調節靶點。

RIP實驗流(liu)程
（一）. 細胞裂解液獲取
A. 單層細胞或者貼壁細胞處理
1. 冷PBS清洗培(pei)養皿或培(pei)養瓶中的細(xi)胞兩次
2. 加(jia)入冷PBS后用細胞刮將細胞刮下來，收集至enpendoff管
3. 1500rpm，4℃離心5min，棄上清，收集細胞
4. 用(yong)與細胞(bao)等(deng)體積的RIP裂解液重懸細胞(bao)，吹打均勻后于冰上(shang)靜置5min
5. 每管分裝200ul細胞裂解液，貯存(cun)于-80℃
B. 懸(xuan)浮細胞處(chu)理：先收集細胞再計(ji)數，然后清(qing)洗裂解
C. 組織樣品(pin)處理
1.冷PBS清洗新鮮切下的組(zu)織(zhi)三次(ci)
2. 加入冷PBS后，用勻漿器或其他(ta)細(xi)胞分離設(she)備使組織分散為(wei)單個細(xi)胞，計數
3. 1500rpm，4℃離心5min，棄上清，收集細胞
4. 用與細(xi)胞等體積的RIP裂解液重懸細(xi)胞，吹打均(jun)勻(yun)后置于冰上靜置5min
5. 每管(guan)分裝200ul細胞裂解液，貯存(cun)于-80℃
（二）. 磁珠的準備
A. 實驗前準備
1、enpendoff管
2、磁力(li)架
3、冰盒， RIP Wash Buffer置于(yu)冰上
4、抗體，置于冰上
5、渦旋震蕩器
6、槍(qiang)、槍(qiang)頭放于超凈臺照射30min，槍(qiang)噴DEPC水
B. 磁珠準備過程
1. 重懸磁珠
2. 標記(ji)實驗所需的enpendoff管(guan)，樣品包括目(mu)的樣品，陰性(xing)對(dui)(dui)照與陽性(xing)對(dui)(dui)照
3. 吸(xi)取(qu)50ul 重懸(xuan)后的磁珠懸(xuan)液于每個(ge)enpendoff管
4. 每管加入500ul RIP Wash Buffer，渦(wo)旋震蕩
5.將enpendoff管置于(yu)磁力(li)架上，并左右轉動15°使磁珠吸附成一條直(zhi)線，去上清(qing)，重(zhong)復(fu)一次
6.用100ul的(de)RIP Wash Buffer重懸(xuan)磁珠，加入約5ug相(xiang)應抗體于每個樣品中
7. 室(shi)溫孵(fu)育30min
8. 將enpendoff管置于磁力(li)架上(shang)(shang)，棄上(shang)(shang)清
9. 加入500ul RIP Wash Buffer，渦(wo)旋震(zhen)蕩(dang)后棄上清，重復一次
10. 加入500ul RIP Wash Buffer，渦旋震蕩后(hou)置于(yu)冰上(shang)
（三）. RNA結合蛋白免疫沉(chen)淀
A. 準備(bei)工作
1、冰盒
2、360°旋轉儀
3、RIP Wash Buffer 、0.5M EDTA 、RNase Inhibitor 置于冰上
B. RNA結合蛋(dan)白免疫(yi)沉淀實驗過(guo)程
1.準備(bei)RIP Immunoprecipitation Buffer
2.將前上步(bu)的enpendoff管(guan)(guan)放磁(ci)力架上，去上清，每管(guan)(guan)加入900ul RIP Immunoprecipitation Buffer
3. 迅速解凍*步(bu)制備的細胞裂解液，14,000rpm，4℃離(li)心10min。吸(xi)取100ul上(shang)清(qing)液于上(shang)一步(bu)的磁珠(zhu)-抗體復合物中，使(shi)得總(zong)體積為1ml
4. 4℃孵育3h至過夜
5. 短暫離心，將enpendoff管放在磁(ci)力架上，棄(qi)上清
6. 加(jia)入500ul RIP Wash Buffer，渦(wo)旋震(zhen)蕩后將(jiang)enpendoff管放在(zai)磁(ci)力架上(shang)，棄(qi)上(shang)清(qing)(qing)，重復(fu)清(qing)(qing)洗6次(ci)
（四）. RNA純(chun)化
A. 實(shi)驗前準備
1.槍(qiang)、槍(qiang)頭、enpendoff管(guan)紫外照(zhao)射30min，噴DEPC水以除RNA酶
2. Salt SolutionⅠ、Salt SolutionⅡ、RIP Wash Buffer、Proteinase K、10%SDS、 Precipitate Enhancer 置于冰上
3.RNase-free的乙醇、（lv）仿(fang)、異(yi)戊醇
4.DEPC水置于冰上
5. 離心機預(yu)冷
6. 冰盒
B. RNA純(chun)化過程(cheng)
1.準備Proteinase K Buffer。每(mei)個樣(yang)品需150ul
2.用(yong)150ul Proteinase K Buffer重懸上述磁珠(zhu)-抗體復合物
3. 55℃孵育30min
4. 孵育完之后，將enpendoff管置于磁(ci)力架(jia)上(shang)，將上(shang)清液吸入一新的enpendoff管中
5. 于每(mei)管上清液(ye)中加入250ulRIP Wash Buffer
6. 于每管加入400ul苯(ben)酚：（lv）仿：異戊醇，渦旋震蕩15s，室(shi)溫(wen)下14,000rpm離心10min
7. 小心的吸取350ul上層(ceng)水(shui)相，吸入另一(yi)新的enpendoff管
8. 于每(mei)管(guan)加(jia)入(ru)400ul（lv）仿，渦(wo)旋(xuan)震(zhen)蕩15s，室溫下(xia)14,000rpm離心10min
9. 小心的(de)吸取300ul上(shang)層水(shui)相(xiang)，吸入另一新的(de)enpendoff管
10. 每(mei)管加入50ul Salt SolutionⅠ，15ul Salt SolutionⅡ,5ul Precipitate Enhancer ，850ul 無水(shui)乙(yi)醇(無RNase)，混合，-80℃保持1h至過夜
11. 14,000rpm，4℃離心(xin)30min，小心(xin)去上(shang)清
12. 用80%乙醇沖洗一次(ci)，14,000rpm，4℃離心15min，小心去(qu)上清(qing)，空氣中晾干.
13. 10-20ul DEPC水(shui)溶(rong)解，-80℃保存，送測(ce)序或進行下游(you)實驗。

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